《应用昆虫学报》

文章标题:苜蓿夜蛾葡萄糖氧化酶cDNA的克隆、表达及特性研究

文章作者:雷 蕾** 赵奎军 高艳玲 李莉莉 樊 东***
关 键 词:苜蓿夜蛾,葡萄糖氧化酶,克隆,表达,酶活性
文章摘要:

【目的】 从苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca体内克隆葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOX)基因cDNA序列,并进行原核表达及活性测定。同时对GOX在不同组织的特异表达及对葡萄糖诱导反应的特性进行研究。【方法】 以苜蓿夜蛾为材料提取总RNA,利用RT-PCRcDNA末端快速扩增技术,扩增苜蓿夜蛾GOX基因全长cDNA序列。利用原核表达载体pET-21b在大肠杆菌中表达苜蓿夜蛾的GOX基因,并用Ni-NTA亲和层析柱将带His-tag的目的蛋白进行纯化,再利用梯度透析法进行复性,以葡萄糖为底物进行酶的活性测定。同时利用Real-time PCR分析GOX的组织特异性表达和对葡萄糖的诱导反应。【结果】 cDNA序列有2 154个碱基,开放阅读框1 824个碱基,编码607个氨基酸组成的多肽,分子量为67.04 ku,多肽的等电点为5.13。该序列命名为HvGOX,在GenBank的登录号为KT907054。序列分析表明,HvGOX的氨基酸序列与其他昆虫的GOX氨基酸序列高度同源。该基因在大肠杆菌表达系统中成功地进行了诱导表达,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。由原核表达载体表达后的蛋白经过变性、纯化和复性后有活性。Real-time PCR 结果表明,该基因在苜蓿夜蛾的不同组织均有mRNA水平的特异表达,其中在唾腺中的表达量最高;同时用0.01%0.1%1%10%葡萄糖溶液浸泡的大豆叶喂食的幼虫,幼虫体内的GOX的表达均被诱导,且在10%的浓度时诱导表达量最高。【结论】 本研究在苜蓿夜蛾体内获得一个新的葡萄糖氧化酶基因,该结果为进一步研究葡萄糖氧化酶在昆虫体内的生物功能奠定基础。