文章标题：苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的克隆与原核表达研究

文章作者：李莉莉** 周晓群 赵奎军 雷 蕾 樊 东***
关 键 词：苜蓿夜蛾，丝氨酸蛋白酶，克隆，原核表达，酶活性
文章摘要：

【目的】 丝氨酸蛋白酶（Serine protease, SP）是以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。在昆虫中，丝氨酸蛋白酶参与消化、发育、先天免疫反应和组织重建等重要的生理过程。本试验以苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca为材料，克隆其丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列，再对该基因进行原核表达并对表达产物进行活性测定研究。【方法】 从苜蓿夜蛾中肠中提取总RNA，通过RT-PCR和RACE技术，扩增获得丝氨酸蛋白酶基因cDNA全长序列，用大肠杆菌E. coli表达系统进行表达；再对表达的重组蛋白进行变性、纯化与复性，并以BTEE为底物进行活性测定。【结果】 克隆得到的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为HvSP，该基因已登录GenBank，登录号为KT907053。该基因全长1 017 bp，开放阅读框为886 bp，编码295个氨基酸，分子量约为30.8 ku，等电点为8.27，推导的氨基酸序列与其他昆虫丝氨酸蛋白酶氨基酸序列相似性在46%～92%之间。在Tris-HCl缓冲液中，pH为8.5时，复性的重组蛋白活性最高，为28.7 U/mL。荧光定量PCR结果表明，HvSP基因的mRNA在苜蓿夜蛾的多个组织中特异性表达，且在中肠中表达量最高，但在唾腺中未检测到HvSP的mRNA表达。【结论】 该研究克隆了一个新的苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列，且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性，为进一步探索丝氨酸蛋白酶在昆虫体内的生理生化功能奠定了基础。