文章标题：沙葱萤叶甲海藻糖磷酸酶基因GdTPP的克隆、原核表达及对温度胁迫的响应

文章作者：路 标1** 周晓榕1 庞保平1*** 董瑞文2 娜布其亚2 那仁满都呼2
关 键 词： 沙葱萤叶甲；海藻糖磷酸酶；基因克隆；温度胁迫；原核表达；表达分析
文章摘要：【目的】 海藻糖磷酸酶（Trealose-6-phosphate phosphatase，TPP）是参与昆虫海藻糖合成的关键酶之一。本研究旨在克隆和表达沙葱萤叶甲Galeruca daurica海藻糖磷酸酶基因，分析其对不同温度胁迫的响应，以期为进一步揭示其在沙葱萤叶甲生长发育及抗寒、耐热中的作用奠定基础。【方法】 根据沙葱萤叶甲转录组数据，通过cDNA 末端快速扩增（Rapid-amplification of cDNA ends，RACE）技术克隆沙葱萤叶甲TPP的全长cDNA序列，并对该基因进行生物信息学分析；将该基因与pET28a载体链接构建表达载体，导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)使其表达；利用实时荧光定量PCR（qPCR）检测TPP基因在沙葱萤叶甲2龄幼虫不同温度下的表达格局。【结果】 克隆获得1条沙葱萤叶甲TPP基因cDNA全长序列（GdTPP，GenBank登录号：MG431210），该基因全长1 372 bp，开放阅读框（ORF）864 bp，编码287个氨基酸；蛋白预测分子量为32.32 ku，等电点（pI）为6.19；无信号肽和跨膜结构；包含2个N-糖基化位点；蛋白质亚细胞定位预测该蛋白位于细胞质中。同源性分析表明，GdTPP与马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata TPP亲缘关系最近。成功构建原核表达载体pET28a-GdTPP，经IPTG诱导，GdTPP在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中高效表达。qPCR结果表明，低于25 ℃对照时，GdTPP表达量随着温度下降而上升，﹣10 ℃时达到最高值，为对照的1.82倍；高于25 ℃对照时，GdTPP表达量随着温度上升而上升，40 ℃时达到最高值，为对照的1.68倍。【结论】 沙葱萤叶甲幼虫通过上调GdTPP的表达来应对高温和低温胁迫，该结果为进一步揭示TPP在昆虫应对温度胁迫过程中的作用奠定了基础。