文章标题：家蚕β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1的 CRISPR敲除载体的构建与导入

文章作者：朱文恺1** 甘 泉1, 2** 贺 伟1 张新伟1, 2 周 跃1 吴梦雪1 孙同
关 键 词： CRISPR/Cas9，基因编辑，sgRNA，家蚕，β-呋喃果糖苷酶
文章摘要：

【目的】 CRISPR/Cas9是近些年报道较多的基因编辑新工具，具有简便高效、特异性强等优势。BmSuc1是从鳞翅目经济昆虫家蚕Bombyx mori体内发现的编码β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase，β-FFase）的基因，也是首个被克隆和鉴定的动物型β-FFase编码基因。β-FFase是作用于果糖基的蔗糖水解酶，BmSUC1可能与家蚕防御桑叶生物碱的生理过程有关，但目前其发挥作用的分子机制尚不清晰。为了解析BmSuc1在蚕体的作用途径及其生理功能，本研究基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建表达双元sgRNA的CRISPR载体，用于敲除家蚕基因组中的BmSuc1基因。【方法】 根据目的基因BmSuc1的ORF序列设计2条sgRNA，通过同源重组的方法分别插入CRISPR载体的Sal I和Nhe I酶切位点。进而利用转基因显微注射技术将该编辑载体注入G₀代蚕卵，经催青孵化饲养家蚕并自交制备G₁代蚕种。【结果】 PCR验证及测序结果均表明CRISPR编辑载体构建成功。根据DsRed2红色蛋白的荧光标记，从G₁代家蚕幼虫中成功筛选出阳性转基因个体。【结论】 本文详细介绍了表达双元sgRNA的CRISPR载体的构建方法，所获得的阳性转基因家蚕对于下一步探讨BmSuc1在家蚕糖类营养的吸收与利用途径中的作用奠定了重要的实验基础，有助于阐明蚕-桑相互选择和适应的分子机制。